质粒DNA作为关键起始材料的监管 & 供应链考量
本文节选自“Regulatory & supply chain implications for plasmids as critical starting materials in the manufacture of viral vector gene therapy products”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
质粒是独立于宿主 DNA 复制的小的环状染色体外 DNA。它们天然存在于E.Coli等细菌中，并为宿主提供竞争优势，包括抗生素抗性以及在极端环境中生存的能力。质粒已成为重组DNA 技术的基本工具。鉴于它们比宿主染色体更小、数量更多，它们可以很容易地以纯化形式分离。此外，它们稳定且易于操纵，可用目的治疗性基因替换非必需遗传物质。在治疗水平上，质粒DNA (pDNA) 正被积极用于 DNA 疫苗和基因疗法，以对抗各种感染性、后天性和遗传性疾病。此外，pDNA 也被用作病毒载体疫苗、mRNA 疫苗和病毒载体基因疗法的关键起始材料。
当通过瞬时转染生产病毒载体时，质粒DNA 的制造至关重要。这些病毒载体产品的制造涉及哺乳动物细胞的转染，使用含有遗传元件的pDNA，包括要纳入病毒载体中的目的治疗基因，以及1到3个含有病毒载体生产辅助功能的pDNA。这些质粒的制造带来了监管方面的挑战，因为质粒DNA 制造商会使用自己的生产工艺，并且在质量和检测方法上存在差异。下文将进一步讨论这些监管挑战。质粒生产指南主要关注其作为治疗药物的用途。然而，质粒也可作为病毒载体生产的关键起始材料。鉴于临床开发后续阶段的监管日益严格，重要的是通过从质量和检测角度评估不同需求，以协调pDNA 的生产和采购。
根据质粒使用的类型（在药物开发中是否用作起始/关键原料、中间体、原料药或药物产品），不仅有不同的机构推动不同的指南，而且针对产品放行也有不同的规格，从生产商到其下游验收。这显然会导致这些质粒的供应链中断，这将在下文中进一步讨论。
质粒DNA设计 & 生产概况
虽然各个质粒生产商利用自己的平台流程来设计和制造质粒DNA，但基本原理与图 1 和图 2 中所示的相同。
图1. 质粒DNA – 设计和优化。含有重组质粒的E.Coli的设计、筛选和优化。
图2. 质粒DNA – 生产概况。主细胞库扩增、高密度发酵和下游纯化
在高水平上，每个重组质粒的骨架都包含一个复制起点、一个用于复制期间选择压力的抗生素抗性基因，以及病毒载体生产所需的优化遗传元件（启动子、增强子、辅助基因、载体转基因等）（图1）。重组质粒用于转化合适的E.Coli菌株，然后选择转化的、抗生素耐受E.Coli的克隆。之后扩增最佳生产克隆，以制备用于进一步质粒生产的主细胞库和工作细胞库。
生产过程采用高密度发酵，以利于生产超螺旋质粒DNA（图2）。在下游纯化过程中，细菌细胞收获、裂解并通过一个或多个层析步骤处理，以富集超螺旋质粒DNA，使其与宿主细胞杂质以及线性、切口和开放/封闭的质粒形式分开。从监管角度看，使用一次性系统生产用于病毒载体制造的质粒的动力正在增加。
使用瞬时转染制造病毒载体的质粒使用指南
在病毒载体生产中，利用适合特定阶段的质量系统放行质粒DNA 很重要，因为围绕用于制造病毒载体的瞬时转染的质粒的监管预期在不断发展。根据欧盟指令2009/120/EC 第 IV 部分第 3.2 节附件以及EMA（欧洲药品管理局）2018 年指南，用于载体制造的质粒被明确定义为先进治疗药物(ATMP) 的起始材料（不作为原材料）。然而，FDA（美国食品和药物管理局）在针对基因治疗 IND（研究性新药）申请的2020 年FDA 化学、制造和控制 (CMC)指南中将这些质粒称为中间体。在 ICH Q7 中，中间体定义为在 API（活性药物成分）加工步骤中产生的材料，该材料在成为API 之前需经过进一步的分子变化或纯化。相比之下，ICHQ7 将起始材料定义为用于生产 API 并作为重要结构片段纳入 API 结构中的材料。
2021 年 4月，EMA 宣布提供有关生产 ATMP 所需的质粒等级的问答(Q&A) 指南。具体而言，EMA 指出，虽然 ATMP 起始材料的生产和检测场所不需要GMP（良好生产规范）证书，但这些场所应符合并遵守GMP 原则。EMA 还澄清说，不需要 QP（质量人员）放行。表 1出现在问答指南中，以帮助阐明 EMA 对使用质粒 DNA 的不同产品所需的GMP 控制水平的期望。梯度系统被用于定义控制水平：深灰色用于表示适用GMP 生产的地方，浅灰色用于表示应适用GMP 原则的地方。例如，对于体内病毒载体基因治疗ATMP的生产，质粒制备以浅灰色显示，表明应遵循GMP原则，但不需要完整的GMP程序。
表1. 来自 2021 年EMA Q&A 的表格，关于生物来源起始材料的 GMP 生产原则，用于转移旨在 ATMP生产的基因材料
2021 年EMA 问答指南还就如何使用基于风险的方法选择要遵循的GMP 原则提供了指导。总结来说，起始材料制造商应获得ATMP制造商的资质。ATMP 制造商应与起始材料制造商就应遵循的程序达成协议。这些程序应与起始材料对药物产品的质量、安全性和功效的潜在影响成正比。此外，问答指南指出，可除菌过滤的无菌或低生物负荷起始材料应遵循相关的灭菌指南和无菌生产规范。
虽然本指南有助于阐明 EMA 的期望，但 FDA 关于质粒控制的最新消息来自于2020 年指南。FDA 将用于瞬时转染、以生产病毒载体的质粒称为“中间体”，具体的 GMP 要求并未定义。2020年指南提到质粒 DNA 应使用经质量确认的库进行制造，并且制造程序、试剂和规格应在 IND 中列出。建议对质粒进行检测，包括无菌性、内毒素、纯度和一致性。有关这些分析的放行检测方法示例，请参见表 2。还应注意的是，早期阶段可能不需要用于质粒中间体细菌库的 MCB（主细胞库），但有关用于生成库的材料的历史和来源的详细信息应在 IND 中进行描述。该指南还列出了用于制造质粒中间体的细菌细胞库的一些推荐测试，包括但不限于，细菌宿主菌株ID、质粒存在、细胞计数、通过限制性酶(RE) 分析确定的质粒 ID、质粒测序和宿主菌株纯度（表 3）。
表2. 用于病毒载体制造的质粒 DNA 放行分析测试和示例方法。
表3. 用于质粒制造的E.Coli主细胞库放行分析测试和示例方法。
考虑到 EMA 和 FDA 给出的各种不同建议，合同质粒制造商必须决定他们将为平台质粒生产工艺和检测策略实施的控制水平。质粒制造商必须考虑他们计划制造的质粒产品的类型，比如是用于病毒载体制造的起始材料质粒，还是其它质粒DNA 疗法和疫苗。由于指南将责任放在每个制造商身上，质粒制造商可能会利用ICH Q6A 和 Q11 指南，并可能将质粒 DNA 的生产视为具有更严格质量控制的原料药，而不是起始材料。在这种情况下，由于下游步骤在非无菌条件下进行（例如柱纯化和切向流过滤），质粒将作为低生物负荷材料装入大批量原料药容器中。通常省略灌装步骤，因为：
用于病毒载体制造时需要大量质粒，
针对大体积的灌装能力通常不可用或无法轻松获得，并增加了不必要的成本
质粒不是提供给患者的最终产品，而是病毒载体产品的起始材料/中间体。
在这种情况下，可以认为灌装到原料药容器中就足够了。此外，作为病毒载体生产过程的一部分，应利用除菌级过滤器对质粒进行额外过滤，以进一步降低污染风险。
病毒载体制造商对于将质粒接受到他们的工厂中、以用于原料药生产过程有自己的要求。大多数病毒载体制造商要求将无菌性作为质粒放行检测，以将质粒DNA 接受到他们的工厂中。然而，根据 ICH Q6A，应该使用生物负荷，而不是无菌性，来放行低生物负荷原料药。在最终产品制造中，不将无菌性赋予成品被认为是标准，因为它已经过无菌测试。无菌性保证来自质量控制和通过培养基灌装以及适当测试证明无菌性的组合。用作起始材料的质粒制造商可能不愿测试起始材料的无菌性，以避免任何误称或表示与预期成品相同的无菌控制水平。因此，质粒原料药的生物负荷限制<1 CFU/10 mL 的情况并不少见。此限制意味着该材料没有微生物污染，但不能声称它是无菌的，因为它不是在与无菌成品预期相同的质量控制和培养基灌装证实水平下制造的。
对于在两个不同的 CMO 进行质粒制造和病毒载体制造的开发商，提前了解这些要求、以避免在将质粒 DNA 引入病毒载体 CMO 时出现任何延迟非常重要。乍一看，这些差异可能会被忽略。
总结
质粒是病毒载体制造的关键起始材料。对于开发商而言，重要的是提前在起始材料制造商和ATMP/病毒载体制造商之间建立健全的供应链，以最大限度地减少质量管理和时间线方面的瓶颈。此外，需推动进一步协调质粒作为病毒载体制造过程中的起始材料/中间体的指南，以及不同制造商在最佳实践和统一标准方面的一致性。
原文：M.Gosse, C.Jones, D.Jesus, et al., Regulatory & supply chain implications forplasmids as critical starting materials in the manufacture of viral vector gene therapy products. Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(2), 279–286
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